来源：爱色谱

1990年，Alpert教授首次提出亲水作用色谱（hydrophilic-interaction chromatography）这个概念，由于这种色谱模式对大极性化合物的分离非常重要，包括很多具有生物活性的化合物，比如药物分子、神经递质、核苷和核苷酸、氨基酸、多肽、蛋白、寡糖、碳水化合物等，因此它在药剂学、药物化学、农业和食品化学、蛋白质组学、代谢组学和糖组学等领域有重要且难以被替代的应用。有意思的是，Alpert本来想用首字母组合“HIC”来代表这种色谱模式，但是由于“HIC”已经被疏水作用色谱（Hydrophobic-Interaction Chromatography）占用了，于是他把这种色谱模式缩写为“HILIC”。

虽然HILIC这个概念在1990年才被提出，实际上这种模式从1975年开始就被用于糖和寡糖的分析，但是早期由于当时只有示差折光检测器（RID）可供选择，因此只能使用等度方法，导致其应用范围非常有限，但是随着新的检测器（ELSD，CAD，MS等）的商业化，HILIC的使用范围大大扩展，逐渐发展成为一种不可忽视的色谱模式。

HILIC模式具有一些独特的优势。首先，它的流动相体系中的溶剂和反相（RP）液相色谱类似，这在一方面可以很好地兼容质谱，特别是电喷雾质谱（ESI-MS），因为富含乙腈的流动相有助于喷雾的形成以及提高离子化效率，从而增强检测灵敏度；另一方面，对于研发实验室来说，就不需要像正相（NP）色谱一样需要准备专用的液相仪器，更加方便。另外，HILIC也因其与反相液相色谱互补的选择性而被大家熟知，它为亲水化合物提供了比反相更好的保留，同时由于其使用的有机相高，液相系统的背压也低。HILIC的另一个优点是它对离子化的碱性化合物有更好的峰形和更高的载样量，而我们知道很多药物分子都属于这一类化合物。最后，在生物分析领域中，当直接进样一些生物样品（比如有机样品提取物、蛋白沉淀上清液、SPE洗出液等）时，就不需要在用乙腈蛋白沉淀后进行溶剂蒸发和重构，另外由于HILIC能保留和分离如Na+、K+、Cl-、Br-、胺、酸等这些常用于与药物分子成盐的抗衡离子，因此可以它来分析成盐的药物成分，这样就不必使用相对比较特殊的离子色谱系统。

可能正是由于HILIC有这么多的优点，从本世纪初开始，基于这种模式的研究和应用也逐渐变多。图1在Web of Science检索“HILIC”或者“hydrophilic interaction liquid chromatography”时出现的文章数在不同年份分布，可以看出近年来对它的研究的热度已经到了一个新的阶段。

图1 1997-2016年在WOS上检索到的HILIC相关的文章数统计图

虽然关于HILIC的研究和发展看上去形势一片大好，但是不可忽略HILIC存在一些缺点，我们走访过很多的实验室，发现很多分析人员对HILIC敬而远之，其最重要的原因是HILIC模式的保留机理比较复杂，很多时候可预测性不强，同时相比反相色谱具有更大概率的重现性问题；另外如何选择合适的固定相和流动相来开发方法也常常比RPLC更困难。

2020年正好是HILIC概念提出的30周年，借这个机会我们将主要从HILIC的保留机理、现在可选的固定相、选择性的控制以及可能出现的问题这四个方面对HILIC进行一个深度的梳理。由于内容很多，为了便于阅读将分成四篇分别介绍，本篇先介绍HILIC的保留机理。

HILIC的保留机理

虽然HILIC已经被广泛地使用，但是其保留机理一直存在争议。其中最被接受的机理模型是基于分析物在流动相和HILIC固定相上的“富水层”之间的分配。HILIC固定相为裸硅胶或者键合了亲水性基团，它可以结合流动相中的水形成一层“富水层”（water enriched layer）（如图2中蓝色部分所示），分析物可以进入这个“富水层”而被保留，同时不同化合物由于在“富水层”和流动相中分配系数不同而实现分离，而这个“富水层”的存在也是HILIC区别于正相的重要特点。这个“水膜”的厚度由很多因素决定，包括固定相的组成、温度以及流动相的离子强度等，因此可以通过改变这些参数来改变化合物在HILIC柱上的保留和选择性。

图2 不同的极性分析物与固定相的作用

虽然大部分HILIC的保留主要基于分配机制，但是很多实验现象不能被这种机制所解释。比如Guo和Gaiki在研究分离弱酸混合物以及核酸碱基和核苷酸混合物时发现改变固定相时（他们尝试过amino、zwitterionic、amide、silica等HILIC固定相），选择性发生了改变。其他的研究也证实了固定相表面修饰的官能团会影响选择性，这些研究表明除了分配作用，还存在由于氢键作用、偶极/偶极作用以及固定相表面的离子化基团与离子化的分析物之间的静电作用而形成的吸引作用和排斥作用等（如上图所示）。可惜的是，Gritti等人研究发现在HILIC模式中分配作用和其他吸引或者排斥作用之间的相对重要程度并不能被预测，因为这由分析物性质和实验条件等多种因素所决定。

我们可以从一个案例中看到HILIC保留机理的复杂性。有如下七种极性不同的氨基酸：

图3 七种极性不同的氨基酸

它们在silica固定相中的保留时间随流动相中乙腈的比例的变化如下：

图4 七种极性不同的氨基酸的保留曲线

可以看到对于相对弱极性的氨基酸（蓝色标记），当乙腈比例高时保留最强，当乙腈逐渐降低到30%时，保留时间迅速减少，最后当水相比较高时保留又逐渐增强，这样保留曲线就呈现“U”形；但对于强极性氨基酸（红色标记）的情况却大有不同，它们的保留时间随着乙腈比例的增加而单调增加，但当水的比例高于70%时，其保留时间几乎不随有机相比例的变化而变化。

图5可以解释不同分析物的保留曲线差异。首先当流动相中乙腈的浓度非常高（或者说水相非常低）时，极性分析物会和吸附在硅醇基团上的水分子竞争，而相对小极性的分析物则不会，因此会出现当有机相达到一定的比例（比如70%）时，大极性化合物保留不再随着有机相的增加而保留明显增强，但是相对小极性的分析物的保留则会继续增强。然后随着乙腈的浓度降低，水的浓度就足以屏蔽硅醇基团，在这个区间内保留就和化合物的极性成正比，分配就成了最主要的保留机制。最后，在流动相中乙腈比例很低处，有一定疏水能力的分析物可能会和吸附在固定相上疏水的硅烷基团上的乙腈竞争，这样其保留曲线就和典型的反相色谱一致，也就是当流动相中乙腈降低时保留增强，这种色谱模式也被称为per aqueous liquid chromatography (PALC)，由于这种模式的流动相中有机相比例很小，因此被认为是非常绿色的液相模式，以后有机会可以专门介绍。

图5 silic柱中水和乙腈过量曲线表面

从上面这个案例可以看到，在HILIC模式中，作用机制比较多元，以最简单的silica为固定相为例，就可能存在亲水分配、氢键、静电等作用，当使用的固定相为键合了其他极性基团时，相应地就会引入对应的其他作用力。

总结

本文介绍了HILIC的保留机理，即一般以亲水分配为主，氢键作用、静电作用、偶极作用、甚至疏水作用等为辅的多作用模式，在某些时候甚至存在亲水分配外的作用占据主导的情况，这为我们的色谱分析带来更多的可能，但是也同时带来更多选择上的困难。在接下来的内容中，我们将介绍目前商业化的几类HILIC固定相并介绍其可以提供的作用力，以拓展大家在进行方法开发时选择色谱柱的空间，也希望为大家选择固定相提供一些方向。

参考文献（略）